[Заглавная страница] [Лекции профессиональных ученых] [Работы начинающих]
[Критика] [ Об авторах ] [Дискуссия] [Форум] [Ссылки][Новости]

Вопрос, задаваемый природе. Принципы экспериментального исследования.

Введение.

"Эксперимент - это вопрос, задаваемый природе." Сегодня мне хотелось бы поговорить о языке, на котором этот вопрос задается, и на котором получается ответ на него.

Заметим вначале, что разработка экспериментальной методики - это, пожалуй, самая творческая и индивидуальная часть в работе исследователя, к которой в наибольшей степени относятся слова Перси Бриджмана, что ученый "в своей атаке на стоящую перед ним частную проблему не испытывает никакого тормозящего влияния прецедента или авторитета, но совершенно свободен принять любой способ, который подскажет ему его изобретательность" (см. "О научном методе" Бриджмана в Дискуссии Школы). Но даже в этой области имеются некоторые общие принципы, которые соблюдаются во всех случаях, о них я и попытаюсь рассказать. Поскольку экспериментальное искусство столь индивидуально, данная лекция неизбежно будет весьма ограниченна - так, какие-то моменты, в ней обсуждаемые, могут оказаться специфичными для моей области знаний - физиология человека и животных. Таким образом, в данной лекции мы имеем дело не столько со строгим изложением теории эксперимента, сколько с очерком моих представлений об экспериментальном искусстве. Вместе с тем, я надеюсь, что последующая дискуссия с читателями позволит уточнить наши представления о теории эксперимента.

Схема "воздействие - эффект"

Итак, разрабатывая интересующую нас проблему, мы приняли некоторую рабочую гипотезу и теперь намерены проверить ее экспериментально. Как же мы должны построить эксперимент?

Не всегда, но очень часто целью эксперимента является установление некоторой причинно-следственной взаимосвязи. Например, мы можем интересоваться, является ли некоторая реакция органа результатом воздействия на него некоторого гормона. Для того чтобы ответить на такой вопрос, существуют два метода - можно разрушить существующую в природе взаимосвязь (скажем, удалить железу, продуцирующую интересующий нас гормон, и посмотреть, сохранится ли реакция органа), а можно, наоборот, смоделировать действие изучаемого фактора (в нашем примере - ввести гормон в кровь и посмотреть, каков будет ответ). Мы видим, впрочем, что в обоих случаях схема эксперимента оказывается сходной - мы выдаем некоторое экспериментальное воздействие и наблюдаем его эффект. В первом случае воздействием было удаление железы, во втором - введение экзогенного гормона. Схема "воздействие - эффект" применяется почти универсально; первая задача исследователя обычно заключается в том, чтобы выбрать подходящее для его целей воздействие, вторая - чтобы придумать адекватный способ регистрации эффекта.

Требования к экспериментальному воздействию.

От воздействия нам требуется, чтобы оно было, если это возможно, элементарным. Элементарным я называю (это не общепринятый термин) такое воздействие, которое изолированно влияет на одно-единственное - изучаемое - свойство объекта. О чем идет речь? Рассмотрим пример - разнообразия ради, из биохимии. Допустим, нас интересует, каким образом связывание гемоглобина с CO2 влияет на его сродство к кислороду. Самое простое решение, какое приходит в голову - это насыщать раствор гемоглобина углекислым газом в разных концентрациях и сравнивать связывание гемоглобина с кислородом в этих условиях. Такой подход, однако, оказывается неприемлемым - поскольку насыщение раствора углекислотой изменит не только концентрацию CO2, но и pH раствора, а pH сама, вероятнее всего, влияет на связывание гемоглобина и кислорода. Можно, правда, попробовать предварительно сильно забуферить раствор, так что небольшое изменение PCO2 не приведет к ощутимому сдвигу pH. Но это тоже не слишком удачное решение, поскольку образующаяся при растворении газа угольная кислота будет все время поглощаться буфером, и получить нужный сдвиг концентрации газа удастся только после того, как буферная емкость будет в значительной мере исчерпана. По-видимому, наилучший путь для решения этой проблемы - заранее приготовить растворы с подобранными концентрациями CO2, после этого скорректировать pH при постоянном пробулькивании раствора углекислым газом. После этого можно вводить кислород и ставить ряд экспериментов на этих - заранее уравновешенных, имеющих одну и ту же pH, - растворах. Таким образом нам удастся существенно приблизиться к идеалу "элементарности" воздействия. Впрочем, если бы мы действительно собирались провести описанное исследование, то и после этого нам следовало бы о многом подумать - ну хотя бы о том, что в наших растворах неизбежно различалось бы содержание ионов, входящих в состав буферов, а мы не знаем, как они взаимодействуют с гемоглобином - так что воздействие все же не вполне элементарно.

На этом, не столь уж сложном, примере мы видим, что требование к воздействию -определенным образом влиять на изучаемый параметр, но не влиять значимо на другие условия эксперимента - имеет очень простую формулировку, но соблюдение этого требования сопряжено со значительными трудностями и требует действительно глубоких знаний изучаемого предмета и тщательного продумывания.

Из требования элементарности воздействия непосредственно вытекает еще одно требование - воздействие должно быть как можно более полно охарактеризовано, то есть, мы должны как можно лучше знать, что именно это воздействие делает с изучаемым объектом. Так например, нас вновь интересует участие некоего гормона в регуляции некоего параметра. Один из возможных способов исследования - ввести в организм антагонист рецепторов к гормону, так что он не сможет влиять на орган-мишень. Это стандартный, широко применяемый экспериментальный прием, но вместе с тем, прием, сопряженный с серьезными трудностями интерпретации. Здесь всегда возникают два вопроса. Во-первых, достаточно ли специфично воздействие? Нет ли у использованного вещества каких-то неучтенных физиологических эффектов? Не действует ли оно еще на какие-нибудь, быть может, неизвестные рецепторы? И во-вторых, достаточна ли использованная концентрация? Достигается ли достаточно полное подавление естественного эффекта гормона? Таким образом, применение фармакологического агента на целостном организме - это почти всегда недостаточно полно охарактеризованное воздействие, следствием чего является сомнение в его элементарности; подобных ситуаций следует, насколько это возможно, избегать, находя более полно изученные воздействия.

Требования к регистрирующей и измерительной аппаратуре

Регистрирующая аппаратура, с помощью которой мы измеряем и фиксируем эффект воздействия, так же может быть источником целого комплекса серьезных проблем, и способ регистрации эффекта требует не менее глубокого продумывания, чем характер воздействия. Прежде всего, результаты измерения должны иметь однозначную интерпретацию. Во всяком случае, из всех возможных экспериментальных подходов следует выбирать наиболее определенный. Приведу пример. Недавно мне встретилось биологическое исследование, в котором автор измерял электропроводность плазмы крови. Признаюсь, это вызвало у меня некоторое недоумение. Достаточно ясно, что электропроводность жидкости зависит главным образом от концентрации в ней ионов. Применительно к плазме крови речь идет в основном о Na+, Cl-, в меньшей степени - K+, Ca++ и HCO3-. Электропроводность плазмы, впрочем, зависит еще от содержания высокомолекулярных веществ - таких, как белки. Все эти величины могут изменяться одновременно и разнонаправленно, так что однозначно интерпретировать результаты измерений электропроводности невозможно. В то же время, не составляет большого труда прямо измерить любую из названных мной величин. Итак, первое правило оказывается очень простым - мы должны точно знать, что именно мы измеряем.

Далее, следует иметь в виду, что никакое измерение не является абсолютно точным. Характеристикой точности измерения является его погрешность - т.е. разность между истинным и измеренным значениями величины. Погрешности делятся на систематические и случайные. Систематическая погрешность - постоянное по величине и знаку отклонение измеряемой величины от истинного значения - чаще всего бывает связана с неисправностью прибора (например, неправильной градуировкой шкалы) или особенностями метода. Например, если измеряют концентрацию какого-то вещества недостаточно специфичным методом, который чувствителен не только к интересующему веществу, но и к постоянно присутствующим примесям, то будут получаться систематически завышенные значения. Систематические ошибки довольно часто могут быть устранены, их обычно довольно легко учесть, а в исследованиях, где сравниваются разные измерения, выполненные одним и тем же прибором, они вообще не сказываются на результате. Случайные погрешности связаны с многообразными разнонаправленными процессами, которые в разных измерениях отклоняют измеренное значение от истинного в разных направлениях и на разную величину. Полностью исключить случайные погрешности невозможно, а оценить можно только в среднем, проведя несколько повторных измерений одной и той же величины. Итак, первое, достаточно очевидное, требование к измерительной аппаратуре состоит в том, что ее погрешность должна быть существенно - хотя бы на порядок - меньше, чем величина ожидаемого исследователем эффекта. Если это вообще достижимо на современном уровне развития экспериментальной техники, разумеется. В то же время, не следует стремиться всегда использовать предельно точные измерительные приборы, поскольку очень точные приборы обычно еще и очень дороги, а разброс измеряемых величин может быть вызван не только приборной погрешностью.

Кроме того, от измерительной аппаратуры обычно требуют, чтобы она создавала объективно документированную запись изучаемого процесса, так, чтобы эту запись впоследствии мог проанализировать сам экспериментатор, или другой исследователь, заинтересовавшийся полученными результатами. Приведенный на рис.1. график мышечного сокращения - хороший пример такой записи.

Рис. 1: сокращение мышцы

Для этого требования существует две веские причины. Во-первых, подобная запись позволяет во время эксперимента сосредоточиться на его проведении, а анализ провести позднее, в спокойной обстановке. Во-вторых, объективная запись позволяет свести к минимуму субъективизм в интерпретации полученных данных. Рассмотрим такой пример. Изучается некоторое воздействие, в результате которого меняется объем клеток. Ставятся две серии опытов; исследователя интересует, в какой из них объем меняется быстрее. Можно попробовать просто смотреть в микроскоп и на глаз оценивать скорость набухания. Достаточно очевидно, что при такой постановке дела результат будет зависеть главным образом от настроения экспериментатора. Можно, однако, записать цифровой видеофильм, раскадрировать его, а затем измерить площадь, занимаемую клетками на полученной последовательности кадров. Это заметно уменьшит субъективизм, но не устранит его полностью. Ведь контуры клеток на картинке не вполне четкие, так что площадь не строго определена, и оператор может провести линию на пару-тройку пикселов правее или левее. Наконец, можно заполнить клетку флуоресцентным красителем и измерять яркость флюоресценции как функцию времени. Тогда при увеличении объема яркость будет падать (потому что краситель будет распределяться в большем объеме), и скорость изменения яркости будет показателем скорости изменения объема. Из этого этапа обработки данных субъективизм устранен полностью, правда появились другие проблемы.

Далее, очевидно, что прибор может зарегистрировать только такое событие, которое как-то воздействует на этот прибор. Но односторонних воздействий в природе не бывает - речь идет всегда о взаимодействии прибора и исследуемого объекта - следовательно, прибор в процессе измерения влияет на поведение изучаемого объекта. В качестве примера, рассмотрим рис.1. На нем представлен график мышечного сокращения, вызванного одиночным нервным импульсом. Сразу после импульса мышца укорачивается (восходящий участок кривой), затем расслабляется (нисходящий участок). Однако, в данный момент для нас наиболее интересен фрагмент, обведенный кружком. Видно, что мышца удлиняется значительно сильнее, чем в базальных условиях, вновь укорачивается и только после этого приобретает обычную длину. Почему это происходит? Чтобы ответить на этот вопрос, рассмотрим внимательнее регистрирующее устройство. Его схема приведена на рис. 2. При сокращении мышцы 1 пишущий конец рычага 5 поднимается и фиксирует сокращение на вращающемся барабане 4. Когда мышца расслабляется, рычаг падает под действием силы тяжести. При этом он успевает набрать довольно большую скорость, так что в конце движения упруго растягивает мышцу, которая затем укорачивается, и полученные затухающие колебания регистрируются прибором. Таким образом, наблюдаемое удлинение мышцы сверх базального уровня в конце фазы расслабления не является ее собственным свойством, но вызывается воздействием на нее со стороны экспериментальной установки. Такие псевдоэффекты, возникающие в результате действия экспериментальной процедуры на объект и искажающие его поведение, принято называть артефактами. В некоторых случаях - как в только что рассмотренном - искусственное происхождение артефакта легко обнаружить, так что он оказывается достаточно безобидным. В более сложных случаях, однако, бывает не так-то легко отличить артефакт от открытия. И здесь опять-таки необходимо глубокое знание всех протекающих в экспериментальной системе процессов - физических, химических и биологических.

Рис. 2: Записывающее устройство - кимограф

Итак, мы выяснили, что экспериментальная процедура сама по себе может влиять на поведение объекта, так что возникает задача различения изучаемого эффекта экспериментального воздействия и побочных эффектов, связанных с измерениями. Как можно решить эту задачу?

План и условия эксперимента

Прежде всего, условия эксперимента должны быть максимально стандартизованы: химический эксперимент должен выполняться при контролируемых и строго определенных pH, ионном составе раствора, температуре, давлении и т.д.; в физиологическом эксперименте животные должны получать стандартную пищу, иметь стандартный световой день, в виварии должна поддерживаться определенная температура, клетки должны чиститься в определенное время и т.д. Заметим, что стандартизировать следует по возможности все условия, даже если не ясно, могут ли они влиять на результат опыта - исследователь ведь никогда не знает всех свойств изучаемого объекта, а поэтому не может быть уверен, что какой-то фактор не влияет на результат.

Итак, условия эксперимента должны быть предельно стандартными. Но абсолют недостижим, и в действительности все условия будут слегка отличаться от опыта к опыту, что будет вносить в результаты дополнительную погрешность, так что общая погрешность экспериментальных результатов будет складываться из двух компонентов - приборной погрешности и погрешности методики. Далее, что разброс данных зависит не только от погрешности эксперимента, но имеет и более фундаментальный источник - а именно, дисперсию свойств экспериментальных объектов. Так, физиологический эксперимент ставится на животных - положим, на крысах. Но никакие две крысы, очевидно, не могут быть вполне идентичными. У них могут быть генетические различия, они выросли в разных клетках - и стало быть, в разных условиях. Поэтому, как говорят старые физиологи, - "ein опыт - kein опыт" (один опыт - не опыт). Для того, чтобы количественно оценить величину погрешности эксперимента (или, используя более общее выражение, величину разброса данных), необходимо поставить серию опытов. Результаты каждого опыта в этой серии будут несколько отличаться друг от друга, но, изучив характер распределения, можно узнать наиболее вероятный результат и количественно описать величину разброса данных. Такое исследование выполняется методами математической статистики, о которой мы подробнее поговорим в следующей лекции.

Кроме того, для того, чтобы выделить эффект изучаемого воздействия из колебаний результатов, вызванных случайными факторами, ставят не одну, а две серии экспериментов - опыт и контроль. Опыт - это серия, в которой на объект выдается исследуемое воздействие; в контрольном эксперименте условия ничем не отличаются от опыта, но исследуемого воздействия не выдается. Подчеркнем специально - отсутствие экспериментального воздействия - это единственное отличие контрольной группы от опытной; все прочие условия должны быть идентичны. Например, если в качестве воздействия у животного удаляют некоторую железу внутренней секреции, чтобы выключить ее гормоны, то в качестве контроля используют не интактное, а ложно оперированное животное - то есть ему проводят всю хирургическую операцию, за исключением собственно изъятия железы. Это необходимо, потому что хирургическая травма входит в тот комплекс экспериментальных условий, который может как-то влиять на результат, и который должен быть идентичным в контрольной и опытной группе. Это требование идентичности настолько важно, что получило специальное название - принцип прочих равных условий. Его соблюдение приведет, в частности, к тому, что артефакты, создаваемые Вашей установкой, будут одинаковы в опытной и контрольной сериях и не повлияют на Ваше заключение об эффекте воздействия.

В том случае, когда на результат могут влиять факторы, изменчивость которых экспериментатор не может контролировать, следует позаботиться по крайней мере о том, чтобы эта изменчивость была сходной в опытной и контрольной сериях. Классический пример: изучается воздействие некоего нового удобрения на урожайность помидоров. Самое простое решение: посадить две грядки помидоров, одну обрабатывать новым удобрением, другую - старыми. Хорошая ли это идея? Не слишком - на разных грядках может оказаться разное качество почвы, или разная освещенность или разная влажность: Полностью стандартизировать условия в полевом эксперименте вряд ли возможно. Одно из решений проблемы состоит в том, чтобы выбрать кусты для обработки новым удобрением на обеих грядках в случайном порядке, то можно рассчитывать, что изменчивость всех этих неучтенных факторов будет примерно одинаковой в опытной и контрольной группах. Такой прием - случайного распределения опытной и контрольной групп по неконтролируемым условиям, получил специальное название рандомизации.

Интерпретация результатов.

Итак, Вы поставили эксперимент, выполнили все промежуточные вычисления, и имеете перед собой две колонки цифр - результаты измерений в опытной и контрольной сериях. Теперь необходимо превратить Ваши данные в научный результат - интерпретировать их. Первый вопрос, на который Вы должны ответить - отличаются ли данные в опыте и контроле. Это не такой тривиальный вопрос, как кажется - ведь величины как в опыте, так и в контроле имеют разброс, независимый от Вашего воздействия; диапазоны опыта и контроля могут в значительной мере перекрываться, так что различие в средних величинах двух групп может быть просто проявлением случайной изменчивости, но может быть и результатом воздействия. Так вот, не существует способа с абсолютной надежностью сказать, действительно ли два случайных набора данных отличаются друг от друга. Однако, методы математической статистики позволяют оценить достоверность различий - то есть вычислить вероятность того, что различия неслучайны. Далее, какой-то определенный уровень достоверности принимают за граничный, после которого можно принять или отбросить гипотезу о неслучайности различия. В биологии существует традиция принимать эту гипотезу если ее вероятность оказывается больше 95%.

Далее, предположим, Вы сделали заключение - различия не случайны. Теперь Вам необходимо объяснить эту разницу. Каким образом, по какому механизму, Ваше экспериментальное воздействие привело к полученным результатам? Здесь Вам придется привлечь все свои знания об изучаемом объекте и экспериментальной методике, глубоко продумать, какие изменения в объекте могло вызвать Ваше воздействие и по каким взаимосвязям оно могло изменять поведение объекта. Это самый сложный этап в интерпретации данных, с которым связано больше всего ошибок - ибо легко можно упустить из вида какую-нибудь существенную взаимосвязь. На сей счет существует - и у экспериментаторов пользуется большой популярностью - следующая шутка: требуется доказать, что таракан слышит ногами. Для этого берем таракана, ставим его на стол и стучим по столу. Таракан начинает бежать. После этого обрываем таракану ноги, вновь помещаем его на стол и стучим по столу. Таракан остается неподвижным. Вывод - он не слышал, как мы стучали. Следовательно, таракан слышит ногами.

И последний вопрос - насколько полученные в опыте данные соответствуют тому, что происходит в природе? По крайней мере в биологии, необходимо ясно отдавать себе отчет в том, что объект, помещенный в условия лабораторного эксперимента, отличается от объекта в его естественном окружении. Следовательно, экспериментальные данные - суть данные, полученные на экспериментальной модели, более или менее отличающейся от объектов, которые можно встретить в природных условиях. Насколько важны эти различия? - вопрос, который должен задавать себе всякий экспериментатор-биолог.

Резюме.

Итак, в этой лекции мы обсудили некоторые принципы экспериментального искусства. Мы выяснили, что эксперимент, как правило, ставится по схеме "воздействие - эффект", при этом мы должны стремиться к элементарности воздействия - так, чтобы оно, по возможности, влияло единственно на изучаемое нами свойство объекта исследования; необходимым условием элементарности является достаточно полная изученность этого воздействия. Далее, мы выяснили, что регистрируемый эффект должен быть однозначно интерпретируем - так что мы должны действительно знать, что именно мы измеряем; желательно, чтобы результаты измерения были объективно документированы - что позволяет, в частности, свести к минимуму субъективизм в интерпретации данных. Мы выяснили, кроме того, что измерения неизбежно имеют некоторую погрешность, вследствие чего оказывается необходимым ставить не единичные эксперименты, но серии экспериментов. Погрешность при этом может быть количественно оценена методами математической статистики. Далее, для того, чтобы отличить эффект воздействия от случайного разброса данных, необходимо ставить две серии экспериментов - опыт и контроль, которые различаются исключительно присутствием или отсутствием экспериментального воздействия и являются идентичными в остальном - принцип прочих равных условий. Мы выяснили, что экспериментальная процедура может менять поведение объекта, порождая ложные эффекты - артефакты; так что интерпретация полученных результатов требует глубокого продумывания с тем, чтобы не принять артефакт от открытия. (К слову, обратные ошибки иногда тоже случаются, хотя и значительно реже). Соблюдение всех этих принципов позволяет минимизировать возможность экспериментальных ошибок - но, увы, не может исключить ее вовсе. Так что еще один - ранее в этой лекции не упоминавшийся - принцип состоит в том, что к своим (да и чужим) экспериментальным данным следует всегда относиться критически; одного экспериментального факта никогда не бывает достаточно, чтобы решить судьбу теории - как мы и говорили в наших первых лекциях. Между прочим, это обстоятельство отражено и в языке науки - в ней почти никогда не используется слово "доказано", но почти всегда говорят - подтверждено; иногда - хорошо подтверждено. Абсолютную истину в эксперименте не получают.

Обсудить эту лекцию на Форуме

1999 Вячеслав Нестеров
хостинг - Узел Синор
дизайн - Sharada Studio